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TUNEL FITC凋亡检测试剂盒
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. 产品说明 
(1) 背景介绍: 
    细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在生物体进化、内环境的稳定以及系统发育中发着重要的作用。细胞凋亡发生在正常的细胞周期循环中,并发生形态学和生理生化的特征性改变,比如细胞皱缩,细胞间连接消失,线粒体膜电位消失,通透性改变,核质浓缩,核膜核仁破碎,DNA 降解成为约 180bp-200bp 的片段;胞膜有小泡状突起,膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面,胞膜结构仍保持完整,最终凋亡细胞遗骸被分割包裹为几个凋亡小体,并迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。以上改变发生在不同的细胞凋亡阶段。细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的 DNA 降解,这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180-200bp 的整倍数,而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度, 提示染色体 DNA 恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断,产生不同长度的寡聚核小体片段,实验证明,这种 DNA 的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体 DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状 Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱。 
 
(2) 检测原理: 
    本试剂盒采用 TUNEL( TdT mediated dUTP Nick  End Labeling)法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 在凋亡细胞断裂的 DNA 的3´-羟基(3´-OH)末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP) 。 FITC-12-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察(图 1)或者用流式细胞仪定量(图 2 和 3) 。试剂盒对标记反应进行了优化,采用最佳比例的荧光素标记和未标记 dNTP 进行 3’-OH 末端的核苷酸掺入,使得同一个断裂的 DNA 片段末端可以形成更长的“标记尾巴,该“标记尾巴”减少了相邻掺入 dNTP 上标记基团的空间位阻,增加每个断裂片段后的荧光基团数目,降低荧光基团相邻后可能造成的聚集和淬灭,从而提高检测灵敏度,减少非特异性反应。
 
2. 产品组成和储存条件
(1) 检测次数:20次 
(2) 检测方法:荧光显微镜或流式细胞仪 
(3) 样本类型:石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、细胞涂片以及细胞悬液 
(4) 试剂盒组分:
• 3ml   10×平衡缓冲液(10×Equilibration Buffer)
• 500μl FITC-12-dUTP 标记混合物(FITC-12-dUTP Labeling Mix)
• 100μl    重组 TdT 酶(Recombinant TdT Enzyme) 
• 200μl   蛋白酶 K(ProteinaseK) 2mg/ml 储液
 
(5) 请使用者自备: 
• 仪器耗材:小型染色缸、湿盒(塑料/玻璃容器与吸水纸) 、盖玻片、封口膜 
• 实验试剂:二甲苯,梯度稀释乙醇溶液(100%、90%、80%、70%) ,Triton® X-100, DNA 酶 I, PI(Sigma 目录号# P4170),DAPI(Sigma 目录号#D9542),不含甲醇的甲醛(普通甲醛为了稳定都加有甲醇,不可使用;多聚甲醛可直接替代不含甲醇的甲醛; ) ,20mM EDTA (pH 8.0),PBS,DNA 酶 I 缓冲液,  
 
(6) 储存条件:
10×平衡缓冲液、重组 TdT 酶和蛋白酶 K 储存于–20℃。 FITC-12-dUTP 标记混合物避光储存于–20℃。这些组分要避免反复冻融。 
 
3.注意事项 
本试剂盒提供的 FITC-12-dUTP 标记混合物是对光敏感的。标记混合物以及反应混合物和包含标记混合物的载玻片要避免光照。  
平衡缓冲液包含二甲胂酸钾(potassium cacodylate) 。避免接触皮肤和眼睛。使用该试剂时戴好手套。